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ELISA是什么檢測方法？一文帶你了解ELISA類型與方法

ELISA（酶聯免疫吸附測定）是一種常用的實驗室免疫測定方法，用于檢測和定量各種生物樣本（例如血清、血漿、尿液、組織勻漿、細胞培養上清液等）中的目標物質，例如蛋白質、肽、激素、抗體、等。   　　在ELISA檢測中，其核心原理是利用抗原抗體之間的特異性結合，以及酶的催化放大作用，來檢測和定量目標物質。抗原或抗體會被吸附到固相載體上，然后通過一系列的孵育和洗滌步驟，最終通過酶催化底物顯色來實現檢測。<o:p></o:p>   <h3>　　ELISA檢測階段：<o:p></o:p></h3>   　　包被/捕獲：包被步驟的目的是將能夠特異性結合待測分子的物質固定在96孔板表面。如果待測分子是抗原，則使用捕獲抗體進行包被；如果待測分子是抗體，則使用抗原進行包被。<o:p></o:p>   　　板封閉：在包被步驟之后，使用封閉液覆蓋96孔板的剩余表面，以阻斷非特異性結合位點，從而降低背景信號并提高信噪比。常用的封閉劑包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、酪蛋白和明膠等。選擇合適的封閉劑取決于具體的ELISA體系和待測物質，需要進行優化以避免干擾抗原抗體反應。<o:p></o:p>   　　檢測：將待測抗體加入到包被有抗原的ELISA板中孵育，然后洗滌。接下來，加入酶標記的二抗，該二抗能夠特異性地結合待測抗體。孵育后洗滌，最后加入底物顯色，通過顏色深淺判斷待測抗體含量。<o:p></o:p>   　　信號測量：使用平板讀取器讀取目標抗原和抗體之間反應產生的信號量。獲得的數據可以是定量的、半定量的和定性的。在定量研究中，濃度結果與標準曲線作圖，將光密度與對數濃度進行比較。<o:p></o:p>   <h2>　　ELISA類型<o:p></o:p></h2>   <h3>　　直接ELISA<o:p></o:p></h3>   　　直接ELISA法將抗原固定在聚苯乙烯微孔板，然后使用蛋白質（牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、酪蛋白和明膠）封閉未結合的位點，孵育后洗滌。<o:p></o:p>   　　在該檢測中，一抗是直接偶聯了酶的，加入底物，酶催化底物顯色，通過顏色深淺判斷抗體含量。由于步驟較少，直接ELISA是一種快速的實驗室工作流程技術，還可消除二抗交叉反應。缺點是反應明敏度低且成本較高。<o:p></o:p>  <img src="/images/upload/Image/直接ELISA.png" alt="直接ELISA" width="500" height="174" /> <h3>　　間接ELISA<o:p></o:p></h3>   　　間接ELISA與直接ELISA在包被、封閉和顯色步驟上相似，主要區別在于檢測方式。間接ELISA使用兩種抗體：未標記的特異性一抗和酶標記的二抗。<o:p></o:p>   　　將抗原固定在聚苯乙烯微孔板，然后使用蛋白質（牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、酪蛋白和明膠）封閉未結合的位點。加入待測抗體（一抗），孵育后洗滌，然后加入酶標記的二抗（例如HRP或AP標記的抗人IgG抗體），該二抗能夠特異性地識別一抗。孵育后洗滌。<o:p></o:p>   　　加入底物，酶催化底物顯色，通過顏色深淺判斷抗體含量。<o:p></o:p>   　　間接ELISA的優點是成本較低，靈敏度更高。但是由于二抗，在檢測過程可能會發生交叉反應。<o:p></o:p>   <h3>　　夾心elisa<o:p></o:p></h3>   　　夾心ELISA用于檢測抗原，其原理是將抗原“夾”在捕獲抗體和檢測抗體之間。首先，將捕獲抗體包被在微孔板表面。捕獲抗體能夠特異性地結合待測抗原上的一個表位。包被后，使用封閉液（例如BSA）封閉未結合的位點，以減少非特異性結合。孵育后，充分洗滌微孔板。然后，將待測抗原加入微孔板中，并孵育一段時間（例如37°C，1-2小時，具體時間需要優化）。孵育后，再次充分洗滌微孔板，以去除未結合的抗原。接下來，加入酶標記的檢測抗體，該抗體能夠特異性地結合待測抗原上的另一個表位。孵育后，再次充分洗滌微孔板，以去除未結合的檢測抗體。最后，根據酶標記的類型選擇合適的底物（例如，HRP常用的底物是TMB）。加入底物后，酶催化底物顯色，使用酶標儀讀取吸光度值，并根據標準曲線計算抗原濃度。<o:p></o:p>   　　夾心ELISA法靈敏度高，但其主要缺點是檢測過程耗時費力。此外，需要找到完美的抗原抗體對也是該檢測法的一個限制。 <img src="/images/upload/Image/夾心ELISA.png" alt="夾心ELISA" width="500" height="311" /><o:p></o:p>   <h3>　　競爭法ELISA<o:p></o:p></h3>   　　競爭法ELISA用于檢測樣本中是否存在抗原特異性抗體。其原理是待測抗體與酶標記的抗體競爭結合有限數量的抗原。<o:p></o:p>   　　將抗原固定在聚苯乙烯微孔板，然后使用蛋白質（牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、酪蛋白和明膠）封閉未結合的位點。 將待測抗體和酶標記的抗體（競爭抗體）混合后加入微孔板中。待測抗體和競爭抗體競爭結合包被在板子上的抗原。孵育洗滌。加入底物，酶催化底物顯色，顏色越深，表示待測抗體含量越低；顏色越淺，表示待測抗體含量越高。通過與標準曲線比較，可以定量測定待測抗體的濃度。<o:p></o:p>   　　該方法不適用于經過任何程度稀釋的樣本，靈敏度較低。但是，該方法具有許多優點，例如，對樣本純化的要求較低、變異性較小，并且可以分析樣本中的多種抗原。 <img src="/images/upload/Image/競爭ELISA.png" alt="競爭ELISA" width="500" height="200" /><o:p></o:p>   <h2>　　常見ELISA檢測方法<o:p></o:p></h2>   　　目前有許多檢測方法來研究抗原抗體復合物之間的反應，例如比色法、熒光法、化學發光法和顯色法。但下面介紹其中最常見的三種方法。<o:p></o:p>   <h3>　　化學發光分析<o:p></o:p></h3>   　　該技術利用過氧化物酶偶聯檢測抗體，如HRP和AP。以魯米諾溶液為底物，形成反應產物，發射出可見光子，然后用光度計讀取。<o:p></o:p>   　　與其他檢測方法相比，該技術超靈敏，動態范圍更廣，甚至可以檢測到給定樣本中最少量的分析物。<o:p></o:p>   <h3>　　顯色測定<o:p></o:p></h3>   　　顯色法是最常見的ELISA檢測方法之一。它涉及使用辣根過氧化物酶(HRP-)或堿性磷酸酶(AP-)標記的抗體與顯色底物（例如四甲基聯苯胺(TMB)溶液）結合使用。<o:p></o:p>   　　該技術利用反應的吸光度來確定讀數，用于比較樣品或根據標準曲線檢測感興趣分子的濃度。<o:p></o:p>   <h3>　　熒光分析<o:p></o:p></h3>   　　該技術將過氧化物酶偶聯檢測抗體（如HRP和AP）與熒光底物相結合，后者在暴露于特定光波長時會發出熒光。即使在分析物濃度較高的情況下，信號也不會飽和，從而提供更準確的結果。<o:p></o:p>   　　通過本文elisa是什么檢測方法介紹，對ELISA檢測方法有所認識。認識ELISA檢測方法，對于日后ELISA實驗檢測至關重要。希望本文內容能夠幫助您在未來實驗取得更大的成功。<o:p></o:p>

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