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elisa底物顯色原理

ELISA是一種廣泛應用于生命科學和生物化學實驗室的酶聯免疫吸附測定實驗，用于定性和定量檢測各種生物分子，例如蛋白質、抗體、肽、糖蛋白和激素。   　　在ELISA實驗中，目標抗原或抗體會被固定在聚苯乙烯微孔板上。然后，加入酶標記的抗體（或抗原，取決于ELISA類型）與目標物質進行特異性結合，并在孵育后形成復合物。未結合的試劑通過洗滌步驟去除。<o:p></o:p>   　　最后，加入特定的底物，酶催化底物反應，產生可檢測的顏色變化或熒光/發光信號。通過測量這些信號，可以定量或定性分析目標物質的濃度。ELISA實驗有多種類型，例如雙抗體夾心法、間接法、競爭法等，每種類型都有其特定的操作步驟和應用場景。<o:p></o:p>   　　ELISA實驗中，在洗滌去除未結合的酶標記物后，將含有反應結合物的ELISA板與合適的底物一起孵育。底物的選擇取決于與抗體偶聯的酶的類型，例如辣根過氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶(AP)。酶催化底物反應，產生可檢測的顏色變化、熒光或發光信號，從而放大信號并可視化板中發生的反應。<o:p></o:p>   　　ELISA實驗中的一些常用底物是過氧化氫、魯米諾和對硝基苯基磷酸鹽(pNPP底物)。在本文中為大家詳細介紹下這些底物在ELISA實驗過程作用方式、它們功能及其在不同醫學和生物技術實驗室和行業中的應用。<o:p></o:p>   　　在ELISA反應體系中，酶標記的抗體（或抗原）與目標抗原（或抗體）結合后，加入相應的底物。酶會催化底物發生化學反應，產生可檢測的信號，例如顏色變化、熒光或電化學信號。這些信號的強度與樣本中目標抗原（或抗體）的濃度成正比?？梢允褂梅止夤舛扔?、熒光計或電化學檢測器等儀器測量這些信號，從而定量樣本中目標物質的含量。<o:p></o:p>   　　不同的底物在與酶發生氧化反應時會產生不同的顏色。例如，辣根過氧化物酶底物與HRP酶反應后會產生以下結果：<o:p></o:p>   <ul> <li>　　ABTS（2,2′-聯苯二胺[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二銨鹽）：綠色<o:p></o:p></li> <li>　　TMB（3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺）：橙色<o:p></o:p></li> <li>　　OPD（鄰苯二胺）：藍色<o:p></o:p></li> </ul>   　　產生的顏色量或獲得的信號與結合固定在96孔板表面的抗原的一抗的量成正比。   <o:p></o:p>  <img src="/images/upload/Image/1(84).png" width="500" height="156" alt="" />   　　為了獲得高質量、一致且可靠的蛋白質測量結果，許多科研人員選擇使用<a href="/category-1-b0.html">ELISA</a><a href="/category-1-b0.html">試劑盒</a>。這些試劑盒提供了進行特定ELISA檢測所需的核心試劑，簡化了操作步驟，縮短了實驗時間。相比于自行配制試劑，使用試劑盒通?？梢詼p少實驗變異性，并提高實驗的重現性。優質的ELISA試劑盒通常具有較高的靈敏度和批次間一致性。然而，不同品牌的試劑盒性能可能存在差異，研究人員應根據具體實驗需求選擇合適的試劑盒，并在實驗前仔細閱讀說明書。部分情況下，仍可能需要自行配制或優化某些試劑。<o:p></o:p>  <img src="/images/upload/Image/1 - 副本.jpg" alt="酶聯生物ELISA試劑盒" width="400" height="300" /> <h3>　　ELISA底物類型<o:p></o:p></h3>   　　根據所使用檢測方法，ELISA底物可分以下幾大類：<o:p></o:p>   　　化學發光底物<o:p></o:p>   　　報告酶-底物反應產生的光被用作化學發光檢測系統的信號。HRP酶使用的化學發光底物溶液包括魯米諾。AP酶需要1,2-二氧雜環丁烷類試劑來產生信號，該信號可被X射線膠片或電荷耦合器件(CCD)相機捕獲。<o:p></o:p>   　　為了增加化學發光信號的強度、持續時間和靈敏度，檢測過程中也使用增強化學發光底物(ECL)。但應對底物進行稀釋，以防止產生假高強度信號。<o:p></o:p>   　　顯色底物<o:p></o:p>   　　這些底物與報告酶反應生成有色的不溶性反應產物，可用分光光度計檢測。該方法中使用的HRP底物包括2'-連氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）；5-氨基水楊酸（5-AS）；3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（TMB）；和鄰苯二胺（OPD）。<o:p></o:p>   　　AP酶的底物是5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽（BCIP）和硝基藍四唑（NBT）。通過使用終止液可以增強所產生的比色信號，從而獲得更準確的信號測量結果。<o:p></o:p>  <img src="/images/upload/Image/顯色底物.png" alt="顯色底物" width="400" height="459" /> 　　熒光底物<o:p></o:p>   　　熒光ELISA底物需要熒光計來產生正確的激發光束，使熒光標簽發出信號。熒光計通過其激發和發射濾光片測量信號。<o:p></o:p>   　　ELISA檢測中使用的熒光AP底物是4-MUP（4-甲基傘形酮磷酸酯），其在發射波長為440nm和激發波長為360nm時產生信號。HPPA（3-對羥基苯基丙酸）和HPA（羥基苯乙酸）底物與過氧化物酶配對。<o:p></o:p>   　　為ELISA檢測選擇合適的底物取決于靈敏度（檢測下限或上限）、時間要求以及過程中所需/使用的檢測設備類型。 <img src="/images/upload/Image/熒光底物.png" alt="熒光底物" width="400" height="402" /><o:p></o:p>   <h3>　　Elisa底物有何用途？<o:p></o:p></h3>   　　ELISA底物對于ELISA檢測、擴增和量化信號至關重要。它們與酶發生反應，產生有色產物或信號，可使用合適的設備進行測量。<o:p></o:p>   　　ELISA是一種生化檢測方法，用于識別和量化生物分子，例如蛋白質、肽、糖蛋白和激素。ELISA板含有抗原抗體（與熒光團或酶結合）復合物的反應混合物，與合適的底物一起孵育，以進行反應可視化，這是ELISA的最后一步。<o:p></o:p>   　　底物與HRP或AP酶發生反應，產生不溶性有色反應產物或信號，通過分光光度計或熒光分光光度計進行測量。<o:p></o:p>   　　為ELISA選擇正確底物是實驗成功關鍵步驟之一。為您的ELISA實驗選擇合適的底物，最大限度地提高實驗的準確性和可靠性！<o:p></o:p>

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