ELISA 基本原理及步驟

<p>&nbsp;<span style="font-size: 12px;"> &nbsp; &nbsp;ELISA技術于20世紀70年代初由荷蘭學者VanWeeman和Schurrs與瑞典學者Engvall和Perlman幾乎同時提出。最初，ELISA主要用于病毒、細菌的檢測。20世紀70年代末，它開始廣泛應用于抗原、抗體的定性和定量測定，包括一些藥物、激素、毒素等半抗原分子的定量檢測。由于ELISA檢測對儀器要求低，操作簡便，特別是樣品前處理簡單，易于推廣，且具有準確、靈敏、快速、特異、經濟等優點，日益成為眾多領域分析技術研究的熱點。</span></p> <p style="text-align: center;"><span style="font-size: 12px;"><img src="/images/upload/Image/微信圖片_20250331164136.jpg" alt="酶聯生物ELISA試劑盒" width="500" height="375" /></span></p> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <h3><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp;</span><strong><span style="font-size: 12px;"> ELISA原理</span></strong></h3> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; ELISA的基礎是抗原或抗體的固相吸附和酶標記。固相載體表面的抗原或抗體仍然保留其免疫活性，而酶標記的抗原或抗體則同時保留了其免疫活性和酶的活性。測定時，待測標本（即其中所含的待測抗體）與固相載體表面的抗原或抗體發生反應。通過洗滌，固相載體上形成的抗原抗體復合物可以與液體中的其他物質分離，然后加入酶標記的抗原或抗體，該抗原或抗體也通過反應結合到固相載體上。此時，固相上的酶量與標本中待測物的含量成一定比例。加入酶反應底物后，底物在酶的催化下生成有色產物。產物的量與標本中待測物的含量直接相關，因此可以根據顏色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率高，間接放大了免疫反應的結果，使檢測方法更加靈敏。可根據試劑來源、標本情況和檢測的具體條件，設計不同類型的檢測方法。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <h3><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; ELISA實驗技巧</span></h3> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 1.加樣</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; ELISA中最常見的操作是加樣，涉及到每個步驟。目前一般使用移液槍加樣，將規定的量加入到板孔中。加樣時，首先要注意將加入的物質加入到板孔底部，避免加入到孔壁的上部，并且不要噴濺或產生氣泡。加入不同物質時應更換噴嘴，避免交叉污染。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 另外，顯色時最好使用多通道移液槍快速完成加液過程，因為顯色對時間要求較高，最好同時顯色，加液時間越均勻，結果誤差越小。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 2.稀釋</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; ELISA實驗中，準確的稀釋操作非常重要。為了獲得可靠的結果，應該使用同一型號的微量移液器和吸頭，并在試管或其他合適的容器中進行稀釋，確保混合均勻后，再將稀釋后的液體加入到板孔中。避免在板孔中直接稀釋，以減少誤差和交叉污染的風險。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 3.洗滌</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 在ELISA過程中，洗滌雖然不是反應步驟，但也決定了實驗的成敗。ELISA依靠洗滌來分離游離和結合的酶標記，去除殘留在板孔中的未與固相抗原或抗體結合的物質，以及反應過程中非特異性吸附到固相載體上的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍存在的，這種非特異性吸附的干擾物質應在洗滌過程中洗掉。可以說，在ELISA操作中，洗滌是最重要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視。操作者應嚴格按照要求進行洗滌，掌握洗滌技術，確保洗滌液充滿每個孔。洗板后，最好在吸水紙上輕輕拍干（選擇干凈、無塵或少吸塵的材質），并嚴格遵守洗滌時間。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 4.顯色</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 顯色是ELISA反應的最后一步，酶催化無色底物生成有色產物。反應溫度和時間也是影響顯色的因素。在一定時間內，陰性孔可以保持無色，而陽性孔則隨著時間的推移顏色逐漸加深。適當提高溫度有助于加快顯色。定量測定時，加入底物后的反應溫度和時間應盡可能準確。定性測定的顯色可在室溫下進行，時間一般無需嚴格控制。有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況，適當縮短或延長反應時間，并及時判斷。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 5.數據讀取</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 比色前應先用干凈的吸水紙吸干酶標板底部附著的液體，以減少對比色的干擾，然后將酶標板正確放入酶標儀的比色架上。酶標儀應放置在避光環境中，操作溫度為15～30℃。使用前應將酶標儀預熱15～30分鐘，以使結果更穩定。</span></div>