告別廢數(shù)據(jù)！ELISA吸光度測量的"黃金法則"

<div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 吸光度（A），又稱光密度（OD）。OD值這個概念，做實驗的朋友們想必都很熟悉。從判斷提取核酸的質量和濃度，到BCA蛋白定量進行蛋白定量，或是ELISA實驗檢測目標蛋白的含量，這些常用的基礎實驗都需要測試樣品的&ldquo;OD值&rdquo;，但&ldquo;OD值&rdquo;究竟是什么？測&ldquo;OD值&rdquo;時我們需要注意哪些問題呢？今天我們就來聊聊這里。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; </span><strong><span style="font-size: 12px;">什么是&ldquo;OD&rdquo;值？</span></strong></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; OD（OpticalDensity）的縮寫，即光密度，也可以稱為吸光度。吸光度是指利用物質特有的吸收光譜來識別物質或測定其含量。將特定波長的光束照射到待檢測物體上，待檢測物體會吸收部分光，通過吸光度計算出待檢測物體的濃度值。一般來說，待檢測物質的濃度越高，吸光度值就越高。實驗中，也會利用&ldquo;OD值&rdquo;與待檢測物質濃度之間的關系來確定吸光度。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp;</span><strong><span style="font-size: 12px;"> &ldquo;OD&rdquo;值檢查工具</span></strong></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 酶標儀，即酶聯(lián)免疫檢測儀，用于檢測ELISA反應后的吸光度值。它主要由光路系統(tǒng)和信號采集系統(tǒng)組成。其工作原理為：</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 光源燈發(fā)出的光波經(jīng)過濾光片或單色器轉變?yōu)橐皇鴨紊猓徊糠謫紊獗粯吮疚眨硪徊糠滞干溥^標本照射到光電探測器上；</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 光電探測器將光信號轉換成相應的電信號，經(jīng)過一系列的信號處理后，送入微處理器進行數(shù)據(jù)處理和計算，最后將結果顯示出來。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp;</span><strong><span style="font-size: 12px;"> 實驗中測量&ldquo;OD值&rdquo;的注意事項</span></strong></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 測量時最需要注意的是光的波長。在介紹&ldquo;OD值&rdquo;這個概念時提到，吸光度利用的是物質特有的吸收光譜。實際操作中我們需要注意的正是這一點。不同物質的吸收光譜不同，最大吸收峰的波長也不同。為了達到最佳的測量效果，一般來說，我們需要在待測物質的最大吸收波長處檢測其&ldquo;OD值&rdquo;。例如，核酸在260nm波長處吸收最大光，而蛋白質和酚類物質在280nm波長處吸收最大光。用BCA法檢測蛋白質含量時，顯色反應后溶液由淺綠色變?yōu)樽仙藭r在560nm處有一個最大吸光值；在采用TMB法的ELISA實驗中，加入終止液后溶液由藍色變?yōu)辄S色，在450nm處有最大吸光值。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 除了吸收波長外，有些實驗還需要設置一個校正波長。校正波長通常遠離最大吸收波長，作為背景吸收，消除氣泡、灰塵等系統(tǒng)誤差造成的&ldquo;OD值&rdquo;偏差。雙波長校正以測得的&ldquo;OD值&rdquo;為基礎，可以有效降低系統(tǒng)誤差的影響。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 測得的待測樣本&ldquo;OD值&rdquo;仍然需要進行折算才能得到最終濃度。很多科研人員經(jīng)常在這一步犯錯，功虧一簣。需要注意的也比較簡單，就是按照相應試劑盒的說明書，使用推薦的曲線擬合方法進行擬合。擬合完成后，需要查看擬合曲線的R2值。如果接近1，證明曲線擬合度越高，結果越可信。如果R2值偏低，則需要檢查是否存在標準品稀釋問題或實驗操作失誤。選擇錯??誤的擬合方法會影響曲線擬合度，R2值偏低，回歸計算出的待測樣本濃度也會不準確。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; <strong>溫馨提示</strong>：BCA蛋白定量實驗及ELISA實驗的顯色過程受反應時間、溫度等條件影響，需根據(jù)實驗情況及時終止實驗才能讀數(shù)。</span></div>