花生過敏原Ara H1(Arah1)ELISA試劑盒
簡介
5α-還原酶(Arah1) 是花生中最主要的過敏原蛋白，占花生總蛋白的12%-16%，分子量為63.5 kDa，屬于豌豆球蛋白類，具有高度的致敏性和熱穩(wěn)定性。Ara H1是花生過敏患者血清中識別率最高的過敏原蛋白，超過90%的花生過敏患者對其產(chǎn)生特異性IgE反應(yīng)。Ara H1的致敏性主要與其IgE結(jié)合位點有關(guān)，這些位點通常位于蛋白質(zhì)的疏水性殘基區(qū)域。Ara H1的致敏性主要與其IgE結(jié)合位點有關(guān)，這些位點通常位于蛋白質(zhì)的疏水性殘基區(qū)域。研究表明，Ara H1可以通過可重復的熒光法形成穩(wěn)定的三聚體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有助于其與IgE結(jié)合。
本試劑盒Arah1免疫測定是一種三步法固相夾心ELISA，用于測量細胞培養(yǎng)上清液、血清和血漿中的Arah1。試劑盒包含大腸桿菌表達重組Arah1和針對重組蛋白產(chǎn)生的抗體。使用天然Arah1獲得的結(jié)果顯示出與使用重組標準品獲得的標準曲線平行的線性曲線。這些結(jié)果表明，該試劑盒可用于測定天然Arah1的相對質(zhì)量值。
檢測原理
試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù)：將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的待測物Arah1，孵育清洗后，再加入生物素標記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”免疫復合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色液后，若樣本中有待測物則顯藍色，則加入終止液停止反應(yīng)。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中Arah1的濃度。
雙抗體夾心模式圖
按操作順序形成抗體夾心結(jié)構(gòu)后，加入TMB底物，板孔液體由無色變成藍色，再加入終止液變?yōu)辄S色后進行吸光度值測定。
檢測實驗的局限性
僅供科研使用，不能用于臨床診斷或治療。
試劑盒的使用期限不得超過試劑盒標簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來源的試劑混合使用或替換使用。
如果樣品產(chǎn)生的值高于最高標準，則用測定稀釋劑進一步稀釋樣品，并重復測定。稀釋劑、實驗員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、培養(yǎng)時間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導致結(jié)合變化。
樣本采集、處理和存儲的變化可能會導致樣本值的差異。
本試劑盒實驗設(shè)計消除了不同生物樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。
操作要點
混合蛋白質(zhì)溶液時，應(yīng)始終避免起泡。為了避免交叉污染，在添加每個標準品、樣品和試劑時應(yīng)更換移液器槍頭。此外，每種試劑應(yīng)單獨使用容器。
確保試劑不間斷地添加到板孔中。為了確保準確的結(jié)果，在孵育步驟中需要粘合好封板膜。
當使用自動洗板機時，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測定精度。
顯色劑應(yīng)保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。顯色劑應(yīng)從無色變?yōu)樗{色。
應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍色變?yōu)辄S色。綠色的孔表示終止液未與基質(zhì)溶液充分混合。
需要的其他材料
1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水
4. 100-1000 mL刻度量筒。
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度。
7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。
注意事項
1. 此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹慎操作。
2. 該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
3. 顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
4. 佩戴防護手套、防護服、眼睛和面部防護用品。處理后徹底洗手。
樣品預處理
下面列出的樣品收集和儲存條件旨在作為一般性指導。樣品穩(wěn)定性尚未評估。
細胞培養(yǎng)上清液：在1000×g下離心15分鐘去除顆粒，立即進行測定或等分裝樣品，并將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復凍融循環(huán)。
血清：使用血清分離管，使樣品在室溫下凝結(jié)30分鐘，然后在1000×g下離心15分鐘。立即取出血清并進行測定或等分裝樣品，將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復凍融循環(huán)。（由于基質(zhì)效應(yīng)，血清樣品建議2倍稀釋。例如：50μL樣品+50μL的1×稀釋液）
血漿：使用EDTA或肝素作為抗凝劑收集血漿。收集后30分鐘內(nèi)，以1000×g離心15分鐘。立即測定或等分裝樣品，并將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復凍融循環(huán)。（由于基質(zhì)效應(yīng)，血漿樣品建議2倍稀釋。例如：50μL樣品+50μL的1×稀釋液）
注：
檸檬酸鹽抗凝劑血漿未經(jīng)驗證可用于本試驗，使用時應(yīng)自行驗證可行性。溶血的樣品不適合用于該測定。
組織勻漿：
用預冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響檢測結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨或勻漿機研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測。
細胞裂解液：
貼壁細胞用預冷PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細胞可直接離心收集。收集的細胞用預冷PBS清洗3次，每1×106個細胞中加入150-200μL的PBS重懸（推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可適當減少PBS體積）并通過反復凍融或超聲使細胞破碎。將提取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測。
其它樣本類型：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。
試劑準備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置：
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）標準品配置：)試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從640ng/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至32ng/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的32ng/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將32ng/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為：32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL，從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0ng/mL)。
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抗體工作液配置:
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。
酶結(jié)合物工作液配置:使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據(jù)所需用量配置。
備注：
如待測樣本中Arah1濃度高于標準品最高值，請根據(jù)實際情況選擇適當?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實驗之前做預實驗，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標準品母液、100×生物素化抗體溶液及100×SA-HRP溶液請根據(jù)實驗所需酶標板孔數(shù)吸取一定量配置工作液，剩余溶液應(yīng)放回2-8℃儲存。
實驗步驟
所有標準品、樣品建議復孔檢測
1.酶標板準備：確定試驗所需要的孔數(shù)，取下未使用的酶標條放回裝有干燥劑的鋁箔袋。
2.樣本孵育：每孔分別加入100μL不同濃度的標準品以及預處理過的待測樣品，蓋上封板膠紙，37℃避光反應(yīng)1.5h。孵育結(jié)束后，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，輕輕晃動30秒，甩干并在紙上拍干，以這種方式清洗3次。
3.抗體孵育：每孔加入100μL生物素化抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膠紙，37℃避光反應(yīng)1h。孵育結(jié)束后，重復步驟2中的清洗方式清洗4次。
4.酶標孵育：每孔加入100μL 1×SA-HRP工作液，蓋上封板膠紙，37℃避光反應(yīng)30分鐘，清洗4次，拍干。
5.底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膠紙，37℃避光反應(yīng)15分鐘。（根據(jù)樣品和對照抗體的顏色，自行控制顯色時間）
6.終止反應(yīng)：待顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μL終止液，輕輕混勻，5分鐘內(nèi)用預熱完成的酶標儀在450nm處測吸光值。
精密度
操作內(nèi)精密度（測定中的精密度）在一塊平板上對兩個已知濃度的樣品進行20次測試，以評估測定內(nèi)精密性。
操作間精度（測定間精度）在10個單獨的測定中測試兩個已知濃度的樣品，以評估測定間精度。至少有三名技術(shù)員進行了實驗。
操作內(nèi)精密度操作間精密度
樣本1212
測定次數(shù)（n）20201010
平均值M（ng/mL）24.485.6623.166.14
標準差SD1.690.462.130.44
變異系數(shù)CV（%）6.9%8.2%9.2%7.1%
回收率
回收率在不同基質(zhì)的整個測定范圍內(nèi)選取在健康血清、血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入3個不同濃度水平計算回收率。
樣本類型范圍（%）平均回收率（%）
血清(n=8)86-10294
血漿(n=8)90-10698
細胞培養(yǎng)上清(n=8)94-110102
靈敏度
經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.25ng/mL。
線性關(guān)系
分別在選取的4份健康血清、血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度Arah1，在標準曲線動力學范圍內(nèi)進行稀釋，評估線性。
稀釋比例回收率（%）血清血漿細胞培養(yǎng)上清
1:2范圍（%）82-9690-9892-112
1:4范圍（%）88-10489-107104-116
1:8范圍（%）85-10292-10199-115
特異性
該試劑盒測定可識別天然和重組Arah1。
其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應(yīng)性。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。
實驗步驟匯總
1.加標準品及樣品，37℃避光反應(yīng)1.5h，洗滌3次。
2.加生物素化抗體，37℃避光反應(yīng)1h，洗滌4次。
3.加酶結(jié)合物，37℃避光反應(yīng)30分鐘，洗滌4次。
4.加顯色液，37℃避光反應(yīng)15分鐘。
5.加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。
結(jié)果的計算
計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線（作圖時去掉空白組的值）。或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標準曲線。
若樣品OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
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